活性氧（ROS）检测---荧光探针法

原理:

荧光探针法通过使用能够穿透细胞膜的荧光探针来实现ROS检测。以DCFH-DA为例，该物质本身呈非极性，可自由穿过细胞膜进入细胞内部。进入细胞后，细胞内的酯酶会将DCFH-DA水解，脱去乙酰基生成DCFH。由于DCFH具有极性，无法自由跨膜，因而只能留在细胞内。当细胞内存在ROS时，DCFH会被ROS氧化，生成具有强荧光特性的DCF。DCF的荧光强度与细胞内ROS的水平呈正相关，通过检测DCF的荧光强度，可以间接反映细胞内ROS的含量。

操作流程：

1. 样本准备：对于细胞样本，需在适宜的培养条件下将细胞培养至对数生长期；对于组织样本，则需先将组织剪碎，进行匀浆处理，随后通过离心去除杂质，取上清液备用。

2. 探针负载：将 DCFH-DA 探针用适宜的缓冲液稀释至适当浓度，加入至细胞悬液或组织样本中，置于 37℃恒温培养箱中孵育 20-30 分钟，以确保探针充分进入细胞并被水解。

3. 清洗样本：使用缓冲液多次洗涤细胞或样本，以去除未进入细胞的 DCFH-DA 探针，防止其对后续检测造成干扰。

4. 检测荧光：将处理完毕的样本置于荧光显微镜下，观察细胞内荧光分布情况，或利用流式细胞仪测定样本的荧光强度。若采用荧光显微镜，可通过拍照记录不同视野下细胞的荧光图像；若使用流式细胞仪，则需先对仪器进行校准，设定适宜的检测参数，如激发光波长、发射光波长等，随后将样本上机检测。

优缺点：

优点：

1. 灵敏度高，能够精准检测细胞内低水平的 ROS 变化。

2. 特异性显著，通过选择不同的荧光探针，可精确检测特定种类的 ROS。

3. 具备细胞水平定位检测功能，直观展现 ROS 在细胞内的分布状况。

4. 广泛适用于多种样本类型，涵盖细胞、组织、微生物等。

缺点：

1. 荧光探针价格相对昂贵，显著增加实验成本。

2. 荧光信号易受细胞内其他物质干扰，例如细胞内的还原剂可能还原 DCF，导致荧光强度下降，影响检测结果准确性。

3. 探针稳定性不足，需避光保存且现用现配，对实验操作要求较高。